近日，华中农业大学曹刚教授和戴金霞副研究员团队在期刊上发表了题为“and π-FISH for in of”的研究成果。本研究开发了新一代荧光原位杂交方法——p-FISH，突破了现有技术壁垒，克服了目前FISH（中）领域的缺点和不足，对不同生物体（动物、植物、病原微生物等））一举“一网打尽”多种生物分子（DNA、mRNA、miRNA、rRNA、蛋白质和小分子等）（图1）。

图 1：π-FISH 照亮并捕获多种生物分子

生物体细胞功能的多样性源于细胞的异质性和组织环境的复杂性。确定组织环境中的细胞类型和分子特性对于分析细胞间相互作用和组织的功能机制尤为重要。近年来，单细胞RNA测序（scRNA-seq）虽然推动了细胞异质性分析，但也伴随着组织微环境和细胞空间信息的缺乏，限制了生命信息的深入解读。荧光原位杂交技术通过特异性杂交分析生物分子的表达水平和空间位置，极大地促进了细胞内基因空间表达信息的探索，加速了我们对组织微环境和功能机制的深入了解。

尽管FISH技术通过不断改进取得了长足的进步，但仍然存在一些挑战：（1）目前的FISH方法通常需要使用约1kb或更长的核酸序列来进行多个目标探针的杂交以产生足够的信号强度，这使得限制短核酸序列的检测； (2)目前的FISH方法只能单独检测DNA、RNA和蛋白质。或者同时检测RNA和蛋白质，尚无同时检测DNA、RNA和蛋白质的有效方法； (3)如何在保证低背景噪声的同时实现高杂交效率和高信号强度仍然是原位杂交技术的关键挑战。

针对当前FISH技术面临的挑战，团队开发了新型荧光原位杂交方法——π-FISH，具有杂交效率高、信号放大能力强、背景噪声低、特异性好、检测通量高、应用范围广等特点。 。该方法具有很强的创新性和优越性，其特点如下：（1）新型π型靶探针（含有2-4个互补碱基对）和U型扩增探针的设计，使得该方法优于目前的方法。 HCR等主流FISH方法具有更高的杂交效率、更低的背景噪音和更强的信号放大能力； （2）该方法可以实现DNA、RNA和蛋白质这一突破对于破译生物大分子复合物参与生命活动调控的机制具有重要意义； (3)目前的FISH方法无法克服短序列的局限性，难以实现短序列的检测。检测RNA（例如）、短序列DNA（例如DNA突变、倒位、异位）和选择性剪接等分子。 π-FISH方法可以高效检测上述短核酸序列分子的空间信息； （4）该方法适用范围非常广泛，可用于动物、植物和微生物（细菌、病毒和寄生虫等）样品的检测，且不限于样品制备限制，适用于冷冻、石蜡和整个胚胎样本。

此外，本研究利用π-FISH方法探索重要的生物学问题，并取得新发现：（1）成功鉴定出前列腺癌患者循环肿瘤细胞中雄激素治疗抵抗标志物雄激素受体剪接变体7（ARV7），解决了这一问题前列腺癌治疗中缺乏准确诊断，为前列腺癌患者雄激素抵抗治疗提供重要的临床指导； (2)该方法通过4个荧光通道组合编码，每轮可同时检测15个基因。因此，通过两轮杂交，在同一张小鼠初级感觉皮层（S1）组织切片上检测到了21个神经元标记基因。不仅再现了小鼠S1皮质不同亚层神经元的空间分布，还绘制了小鼠S1皮质13个抑制性神经元亚群的空间图（图2）； (3)由于π-FISH具有较高的灵敏度，本研究首次发现肿瘤细胞周期的关键调控因子具有三种不同的亚细胞定位模式。其中，核聚集模式与-5p表现出高度共定位。这些研究证明了π-FISH技术在基础科学研究和临床诊断方面的巨大潜力。

图2：小鼠初级体感皮层（S1）神经元空间图的π-FISH原位分析

综上所述，本研究开发了一种高效、特异性强、信号强、背景噪声低的多重π-FISH方法，可广泛应用于多种生物分子、细胞亚群的高效检测以及空间图谱的原位注释，染色体变异的原位验证、多种蛋白质的共检测以及短核酸序列的检测为生命科学研究和临床诊断提供了有力的工具。

我校曹刚教授和戴金霞副研究员为本文的共同通讯作者，博士生陶迎峰和周小六为本文的共同第一作者。农业微生物资源发现与利用国家重点实验室为本研究提供了有力帮助。我校李云光老师、施春梅老师在影像技术方面提供了支持。该研究得到了国家自然科学基金、广东省重点研发计划、中央高校基本科研业务费专项资金项目的资助。

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